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空气微生物采样器

当人的呼吸道由于寒冷、紧张、劳累等因素而出现抵抗力下降时，空气中的微生物就会乘虚而人，引起呼吸道疾病，如流感、白喉、感冒、支气管炎、肺炎等 。当你的皮肤出现破损、伤口等时，空气中的微生物也会侵入皮肤，造成皮肤感染．如疖、痈或脚癣等 。空气中的某些真菌，还是哮喘的罪魁祸首 。
国内外大量研究或果表明，在室内外的不同环境中，空气微生物的污染对人体健康可能造成直接或间接的危害，已经成为目前重要的公共环境卫生问题之一 。为了控制空气微生物的污染，必须对空气微生物进行采集，并鉴别微生物的种类和计算菌落数 。
(一)空气微生物的采样和分析方法
1．空气微生物的采样方法
空气微生物采样器的研究已经有l00多年的历史，不仅发展迅速．而且种类繁多 。按采样原理不同大致可分为：过滤式、撞击式、离心式和液体冲击式采样器 。以上各种采样器都必须吸引空气进入采样器，才能收集空气微生物 。目前国际上公认的定量采样方法是撞击式空气微生物采样器，其中安德森采样器是通用的测定空气细菌和真菌粒子浓度的标准仪器 。
按使用上的可移动性能不同可分为固定式、便携式和个体采样器三种式样 。固定式采样器主要用于室外采集空气过敏源；便携式采样器广泛用于室内环境中微生物污染调查研究和例行采样；个体采样器是一类体积很小的袖珍式采样器，可以佩戴在人体上，利用过滤作用或撞击原理收集空气微生物，监测人们活动过程中的个体接触量 。
另外，还有一称“平皿法”的空气微生物采样方法，它是利用微粒的重力沉降和惯性过程的组合作用，将空气微生物收集在半固态的营养培养基上，所以也称为“自然沉降法”或“重力采样器” 。这种采样方法操作简单，但平板在空气中暴露5min时，仅收集到很薄(≤10cm)的空气层中的粒子，采样数据不具有代表性 。加上采样效率受风速、风向和携带微生物的粒子大小等影响很大，在定性和定量上缺乏准确性 。
2．空气微生物的分析方法
空气微生物的分析方法分为两大类：即培养方法和非培养直接计数方法 。
(1)培养方法培养方法是将采集到的活的空气微生物，在半固态的营养培养基上经过培养繁殖生成菌落，用目视鉴别和计数，其结果用“菌落数”(CFU)表示 。培养方法只能测定经过培养能够繁殖的微生物 。在选定的培养条件下，可培养的微生物仅是选定培养部分活的微生物．而不是全部活的微生物都能够培养生长成菌落 。培养方法的影响因素有：微生物活性、培养介质、培养条件，以及不同微生物：之间的相互作用 。
空气微生物计数的准确度主要是受平板上菌落的大小和平板上菌落表面密度的影响 。在标准平板上，范围在30~300CFU比较合适 。菌落数太少不具有代表性，缺乏统计学意义；菌落数太多，计数非常困难 。
因此，用培养方法分析样品，必须根据采样目的和空气环境类型，选择适当的采样时间，使每一个样品都收集到足够的带菌粒子是非常重要的，以保证采样结果在统计学上具有显著性和代表性 。因为塑料培养皿上的静电电荷的吸附作用，在撞击式采样器中，使用塑料培养皿会引起收集效率降低20％，所以一般应选用标准玻璃培养皿 。
(2)非培养直接计数方法非培养直接计数方法是在采样后的样品不经过培养就可进行微生物鉴别和计数的方法，不要求微生物能否培养，所有的微生物粒子，包括死的或活的，凡是使人致病的全部微生物粒子都应当计数 。因此，直接计数方法测出来的微生物数量往往比培养方法的高得多 。
目前，使用的几种直接计数方法仪器有：光学显微镜、荧光显微镜、扫描电子显微镜和流通式血球计等 。采用显微镜计数，在六级安德森采样器收集到高至40000～50000CFU范围内仍可计数 。非培养直接计数方法中，扫描电子显微镜比光学显微镜的分辨率高，计数也比较准确．但设备价格较高 。
3．选用采样器的基本原则
如何选用空气微生物采样器的问题，在一般情况下，主要从空气微生物采样器性能、采样目的和空气环境类型来考虑 。
(1)采样器性能不同种类空气微生物采样器的性能也有较大的差异，采集空气微生物有一个最佳效率范围 。在一般情况下，空气微生物采样器采集小粒子都有很高的效率 。但是，表面空气微生物采样器(SAS)、孢子采样器和离心式采样器，采集小粒子效率却很低 。
室内空气微生物污染的程度是衡量室内空气质量好坏的重要参数之一，要求空气微生物采样器，必须具有获得最大的采样效率，以确保采集到的空气微生物在统计学上有显著性和代表性 。将空气微生物收集在半固态的营养培养基上的撞击式采样器，采样浓度一般不应超过105CFU／m3，否则会发生超载现象 。同时，要求采样器的空气采样流量要稳定，这样才能确保采样性能稳定可靠 。如果使用非恒流型采样器采样时，必须经常校准空气采样流量 。
在住宅、办公室、学校等一般生活、工作和学习场所，进行室内空气质量评价、研究空气细菌污染与在室内人数、劳动强度、通风量以及污染源的关系时，可考虑选用将空气微生物收集在半固态的营养培养基上的撞击式采样器 。如安德森采样器和恒流撞击式采样器，既能够反映出空气微生物的污染水平，又能够定出可吸人与非可吸人粒子上携带的微生物浓度，评价其粒度分布状况及潜在的致病危害程度 。在测定空气过敏原的活性时，可选用滤膜式空气采样器 。另外，还应当从测定微生物所用的分析方法来考虑选择采样器，每一种分析方法都有具一定的局限性 。
在实际的采样应用中，往往不能确切预知有关的空气微生物的种类和浓度的情况下，这时可考虑用多种采样器及多种分析方法联合测定 。例如，在废物处理场所测定空气细菌、真菌和酵母，研究空气亍亏染与环境因素的关系时，可采用全玻璃三级冲击采样器、安德森采样器和滤膜式空气采样器，联合采样测定空气微生物的种类和浓度 。
(2)采样的目的应依据采样目的来选用空气微生物采样器 。例如，仅仅要求测定空气中的细菌总数，还是要求测定各种活的空气微生物，或者要求测定所有的微生物粒子，或者还需要进一步了解空气中携带微生物的微粒粒度大小的分布状态 。根据上述各种采样目的，确定选用将空气微生物收集在液体介质中、固态培养基上或者滤膜上的空气微生物采样器 。
(3)空气环境类型测试结果证明，不同的环境空气类型，在不同位置(有无污染源)、时间、季节和气候状态下，待采集的空气微生物在种类和污染程度上有很大差异 。空气微生物粒度大小不一，差异也很大 。细菌在0.5～1.0μm，真菌在3～100μm，许多真菌孢子粒径在1～5μm，病毒则为0.01～0.1μm 。
在室内空气中带菌的可吸人粒子数((CFU／m3)可占50％～90％ 。空气微生物污染严重时，应当考虑不容易或者不会发生超载的采样器 。
(二)过滤式微生物采样器
过滤式空气微生物采样器，是世界上应用最早的空气采样技术之一 。大约在20世纪30年代末，美国人采用纤维薄膜作为过滤材料，所以也称为滤膜过滤式采样器 。这种采样器可以单独使用，也可以与其他采样器联合使用．广泛用于室内外环境中空气微生物污染的调查研究和例行采样 。具有采样灵敏度高、采样效率高、使用范围广等特点 。
1．采样原理和仪器结构
(1)采样的原理过滤式空气微生物采样器采样的工作原理，不仅是能阻拦大于滤膜孔径的微生物粒子，而且通过惯性撞击、扩散、重力沉降和静电吸附作用能捕集生物小粒子，所以其阻留效率高 。仪器工作时，由抽气泵抽取待测环境中一定量的空气，空气中的生物粒子被阻留在滤膜上 。将滤膜贴在固体培养基上，在适宜的温度下，滤膜上的微生物在培养基上生长成菌落，按照采样时间和采样空气流量计算出空气微生物粒子浓度 。
(2)采样器结构单机过滤式空气微生物采样器的总体结构，主要分为采样装置、抽气和流量计测装置及支架三大部分 。采样中使用的泵，一般为恒流泵，可以用干电池作为抽气动力源，使用起来非常方便 。依据所使用的滤料不同，过滤式空气微生物采样器可分为滤纸空气微生物采样器和滤膜空气微生物采样器 。
①滤纸空气微生物采样器 。在采样夹里放置定量滤纸或玻璃纤维滤纸等作为滤料 。滤纸是多孑L性的，孑L的结构弯曲 。孔径5μm多孔性滤纸空气微生物采样器在收集0.3μm的细菌微粒时．采样效率不小于95％ 。
②滤膜空气微生物采样器 。在采样夹里放置聚碳酸酯核孔薄膜作为滤料 。滤膜中孔的结构是直孔，通常使用的孔径为0.35～0.50／μm，孔径大小一致性好 。采样效率主要取决于滤膜孔径大小 。孔径为0.60／μm滤膜采样器的采样效率，相当于孔径为5μm滤纸空气采样器的采样效率 。另外，滤膜表面光滑，比滤纸更有利于分析测定 。滤膜过滤器收集的霉菌和放线菌的孢子，用电子扫描显微镜计数 。
2．仪器技术指标和要求
空气采样器的技术指标应符合下列要求：①采样效率应接近l00％；②空气采样流量：便携式滤膜采样器恒流流量为0.5L／min、1.0L／min、2.0L／min；③大流量滤膜式采样器流量1m3／min；④滤膜孔径：聚碳酸酯核孔薄膜孔径常用0.35～0.50／μm 。
3．采样和测定具体步骤
(1)安装与消毒将选择好的滤膜安装在采样夹里，并认真检查安装是否合乎要求，然后用紫外线(UV)将滤膜和采样夹进行消毒 。
(2)进行采样过滤式空气采样器的空气采样流量准确程度直接影响采样结果，在采样前应用皂膜流量计校准采样泵的流量 。将采样夹用真空管与便携式恒流采样泵连接，启动采样泵进行采样 。
(3)细菌培养和计数
①直接计数法采样完毕后，采用非培养方法分析，即样品不经过培养，就鉴别和计数收集在滤料上的微生物 。
②细菌培养法采样完毕后，取下滤膜，直接放在培养基上培养，或者用聚山梨醇酯80溶液将微生物洗脱下来，悬浮于液体中，逐级：进行稀释，接种平板后培养，计数菌落数 。
4．采样结果计算
(1)采样完毕后，采用非培养法分析；或者将滤膜取下直接放在培养基上培养，计数菌落数，求出单位体积(m3)空气中的菌落数，以CFU／m3报告测定结果 。空气中的菌落数可用式(6—5)计算：
C—l000N/FQt(6-5)
式中，C为空气中的菌落数，CFU／m3；N为计数平板上的菌落数 。CFU；F为平板或滤膜分量；Q为采样流量，L／min；t为采样时间，min 。
(2)采样完毕后，用聚山梨醇酯80溶液将滤膜上的微生物洗脱下来，悬浮于液体中，逐级进行稀释，接种平板后培养，求出单位体积(ITl3)空气中的菌落数，以CFU／m3报告测定结果 。空气中的菌落数可用式(6—6)计算：
C—1000?VN／FQt(6—6)
式中，C为空气中的菌落数，CFU／m3；f为溶液稀释因子；V为最终溶液体积，mL；N为计数平板上的菌落数，CFU；F为平板或滤膜分量；Q为采样流量，L／min；t为采样时间，min 。
(三)安德森撞击式采样器
安德森撞击式采样器是一种先进的空气微生物采样仪器，在采样和测定空气微生物浓度方面具有准确性和可靠性 。国际微生物会议和美国＊＊工业卫生学家协会推荐为标准空气微生物采样器，也是应用最广泛的空气微生物采样器 。
1．采样原理和仪器结构
(1)采样原理安德森撞击式采样器是利用微粒的惯性撞击作用，直接将空气微生物收集于半固态的营养琼脂表面上，采样后可直接进行培养、计数，测定出每立方米空气中所含的微生物菌落数(CFU／m3) 。
撞击式采样器采集空气中的粒子上携带的活细菌和真菌，在半固态的营养培养基上或者黏附表面上，其理论依据是微粒惯性撞击原理 。依据惯性撞击原理收集微粒的采样原理采样时，当微粒随着有一定流速的气流通过圆孔小喷孔后，粒径较大的微粒具有足够大的惯性时，就会做惯性运动，并会离开气流，撞击于琼脂表面上被收集下来；较小的未撞击的微粒，惯性小的就会随着气流(箭头指引的方向)运动被带走，然后进人次一级 。
(2)仪器结构安德森撞击采样器是一种多孔撞击式空气微生物采样器，在实际空气微生物采样中采用的有：八级安德森撞击采样器、六级安德森撞击采样器、二级安德森撞击采样器和一级安德森撞击采样器，常用的是前三者 。
①八级安德森撞击采样器 。八级安德森撞击采样器是一个多级，多孔的阶式撞击采样器．用于大气中的颗粒物分级采集，分析质量浓度和粒径分布 。撞击采样器根据空气动力学原理设计，由8个撞击盘组成，每个撞击盘具有数量和直径经过严格设计的加速喷射小孔 。
采样气流经过每一级撞击盘时，其中较大的颗粒由于惯性作用，直接撞击并停留在撞击盘的表面，而较小的颗粒则随空气流穿过，到达下一级撞击盘 。不同空气动力学粒径的气溶胶粒子根据空气动力学原理被分离并采集到各级采样膜上，膜片用于重量和颗粒物成分分析 。
②六级安德森撞击采样器 。六级安德森撞击采样器是由六个撞击器组合成一体，每一级实际是一个单级采样器，利用6次反复撞击原理，绝大部分粒子特别是在气管及肺沉降的粒子基本都撞击下来，因而它采集到的粒子大小范围自然比单级的广，这是一些单级撞击采样器所无法比拟的 。六级空气微生物采样器模拟人呼吸道的解剖结构和空气动力学生理特征，采样惯性撞击原理而将悬浮在空气中的微生物粒子分等级地收集到采样介质表面上，然后供培养及微生物学分析 。六级安德森空气微生物采样器整个仪器是由撞击器、主机(流量计)、定时器、三脚架组成 。
③二级安德森撞击采样器 。二级安德森撞击采样器是改进型采样器，适用于室内外环境空气微生物污染调查研究和例行采样．如医院、生物洁净室和工业中微生物污染的检测和评价 。二级安德森撞击采样器依据微粒惯性撞击原理，能够测定出空气中所含的微生物浓度，反映出空气微生物污染水平，又可测出可吸人与非可吸人粒子上携带的微生物浓度，评价其粒度分布状况及潜在的致病危害程度 。二级安德森撞击采样器设有空气采样流量自动控制装置 。当所用的真空泵的采样负压≥0047MPa时，采样流量就可达到28.3L／min 。不需使用调节阀门和流量计等部件，一般情况下不需要校准，从而提高了采样结果的可靠性 。与八级、六级安德森撞击采样器相比，使用平板数量少，结构比较简单 。
④一级安德森撞击采样器 。一级安德森撞击采样器是有400个孔的单级空气采样器，适用于测定每立方米空气中所含的微生物菌落，}基数(CFU／m3) 。1987年，在国际生物气溶胶会议上，美国＊＊工业卫生学家协会(ACGIH)将一级安德森撞击采样器推荐为室内空气微生物采样器 。一级安德森撞击采样器没有稳流控制系统，需要使用调节阀门和流量计等部件，调节采样器的空气采样流量达到28.3L／min 。
2．仪器检定和校准要求
一级、六级和八级安德森撞击采样器在用于采样之前，需要使用调节阀门和流量计等部件，调节采样器的空气采样流量达到28.3L／min 。为了提高采样结果的可靠性，必须经常使用标准校准装置(干气体流量计)校准空气采样流量 。只要采样器的空气采样流量达到28.3L／min，采样器的收集效率就会不小于95％ 。
二级安德森撞击采样器设有恒流装置，只需要真空泵的采样负压≥0．047MPa时，采样流量就可达到28.3L／min 。因此，对于二级安德森撞击采样器，需要监控真空泵的采样负压是否符合设计要求 。只要负压达到设计要求，采样器的收集效率就会不小于95％ 。
3．采样和测定操作步骤
各种安德森撞击采样器，主要是所使用的营养琼脂平板数量不同，在采样和测定操作步骤上稍有差异 。这里仅介绍六级安德森撞击采样器的采样和测定操作步骤，其他的安德森撞击采样器可以参照操作 。
(1)采样器的装配
①移去营养琼脂平板皿盖，将一个营养琼脂平板放置于采样器底座的3个圆柱支子上，将第六级圆盘小心盖在平板上，再将第二个营养琼脂平板放置于采样器底座的3个圆柱支子上 。按照这样的方法，连续将所有6个平板装入采样器内，再小心将人口顶盖盖在第一级上 。所有的平板在装人采样器内之前应当维持在室温状态 。
②装配完毕后，将底座上的出口接头连接到真空泵或其他抽真空源上 。
(2)进行采样操作
①依据空气环境的类型和采样目的，采样时间选择在数分钟至30min范围内某一数值为宜 。使每一个样品都收集到足够的带菌粒子是很重要的，以便能够保证采样结果在统计学上具有显著性和代表性 。然后每个平板上，菌落数超过300CFU，会造成计数困难 。采样时间也不宜超过30min，否则营养琼脂平板上的水分损失而影响细菌活性 。
②按动真空泵开关到“ON”位置，采样工作开始，采样气流通过采样器 。关闭真空泵开关，记录采样时间以及采样点的气温、大气压力和相对湿度 。
(3)样品保存采样完毕后，从采样器中取出营养琼脂平板，盖上皿盖；做好记录，分别标出样品号和级别号，如l—1、1—2、1—3、… 。
(4)细菌培养样品培养后，用标准细菌菌落计数器，计数每一个平板上的菌落数，也可以用¨阳性孑L计数方法”，计数平板上的菌落数，然后用平板上的菌落数的数值，在“400孔采样器阳性孔修正表”中查出对应的修正后的菌落数 。
(5)结果计算
①菌落总数 。每次采样，将6个平板上的菌落数的总和除以空气采样体积，可求出每立方米(m3)空气中的菌落数，以CFU／m3报告结果 。其中空气采样体积等于空气采样流量乘以采样时间 。空气中的菌落数可用式(6—7)计算：
C一1000(N1+N2+N3+N4+N5+N6)／28.3t(6—7)
式中，C为空气中的菌落数，CFU／m3；Nl～N6分别为第一级至第六级平板上修正后的菌落数，CFU；28.3为空气采样流量，L／min；t为采样的时间，min 。
②各级菌落数的比例 。在六级安德森撞击采样器中，将第一级平板上的菌落数除以6个平板上的菌落数总和，可求出第一级平板上的菌落数所占的比例，用％表示，其余类推 。
(四)恒流撞击式采样器
恒流撞击式空气微生物采样器，是根据我国室内空气微生物检测的实际状况，设计制作的一种两级多孔撞击式采样器 。使用90mm标准玻璃培养皿，符合空气细菌总数标准检验方法的要求，测定出每立方米空气中所含的细菌和真菌的菌落数，同时测定出空气中带菌的可吸人与非可吸人粒子的浓度 。这种采样器具有采样灵敏度高、操作简便、装卸方便、寿命较长、噪声较低、自控恒流、自控关泵等优点 。
1．采样原理和仪器结构
(1)采样原理恒流撞击式空气微生物采样器的采样原理，与安德森撞击采样器一样，是依据微粒惯性撞击原理设计的 。将空气中携带的活细菌和真菌粒子采集在半固态的营养培养基上，培养后计数，用每立方米空气中所含的微生物菌落数(CFU／m3)报告结果 。
恒流撞击式空气微生物采样器是两级采样器，第一级的喷孔直径必须比第二级的大，气体流速则比第二级的小 。控制空气采样流量恒定在30L／min 。采样时，在采样器第一级的气体流速V0下，较大粒子就有足够大的惯性而做惯性运动，离开气流撞击在第一级琼脂表面上被收集下来；较小的未撞击的微粒随气流进人第二级被收集在营养琼脂平板上 。由此，就能把带菌的可吸人和非可吸人微粒有效地分开 。
第一级采集空气中非可吸人粒子上携带的活细菌和真菌等微生物，第二级采集可吸人粒子上的微生物，分别给出每立方米空气中所含的细菌和真菌的菌落数(CFU／m3) 。用这种采样器不仅反映出空气微生物污染水平，而且又可评价空气中携带微生物的可吸人与非可吸人粒子的分布状况及其潜在的致病危害程度 。
(2)采样器的结构恒流撞击式空气微生物采样器包括两级撞击式采样器、流量控制系统、真空泵和智能双数显控制器等部件，恒流撞击式采样器的结构组成 。恒流撞击式采样器空气采样流量为30L／min，两级撞击式采样器由铝合金底座、有200个圆形小喷孔的第一级和第二级圆盘、顶盖及3个带螺钉不锈钢固定杆组成 。
2．培养基及平板制备
(1)培养基制备空气细菌测定的营养琼脂培养基成分和制备方法如下：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、氯化钠5g、琼脂15～20g、蒸馏水l000L混合后加热溶解，校正至pH7.4，过滤分装，以20min的时间采用l21℃高压灭菌 。也可以根据用户要求采用其他培养基成分制备平板 。
(2)平板的制备空气中细菌的测定所用平板的制备，按照《室内空气质量标准》(GB／Tl8883一2002)中附录D的方法，移取20mL的45～50℃灭菌营养琼脂，加人90cm无菌玻璃培养皿内 。制备成琼脂平板，盖上皿盖 。
3．采样和测定步骤
(1)采样时间和显示设定在采样操作之前，首先需要设定采样时间长短及其显示方式 。我国生产的恒流撞击式空气微生物采样器 。多数配备智能双数显控制器，具有自控关泵的功能 。在正常工作时，它能够显示采样时间和设定值，采样自动计时，当运行时间达到设定值，自动关闭真空泵，停止采样 。
(2)采样器的装配
①打开营养琼脂平板皿盖，将一个营养琼脂平板放置于底座的3个圆柱支子上 。将第二级圆盘小心盖在底座上，将另一个营养琼脂平板放置于第二级圆盘上部的．3个圆柱支子上，小心盖上第一级．再小心盖上顶盖 。将3个固定杆竖起，将螺钉对准顶盖上部环状槽，顺时针轻轻旋紧 。
②将真空软管连接于底座的排气口接头上，另一端连接到真空泵进气口接头上 。采样气流从顶盖上进气口的方向吸人采样器，然后从底座接头上的排气口指示的方向排出真空泵 。
(3)进行空气采样按动复位键或重新接通电源，此时电源POW指示灯和输出OUT指示灯交替闪烁．表明采样开始 。采样运行时间达到规定时间，OUT指示灯自动熄灭，真空泵自动关闭，停止采样 。采样完毕后，记录采样时间、采样点气温、大气压力和相对湿度 。
(4)样品保存将3个固定杆的螺钉反时针旋松离开顶盖环状槽，移去顶盖和第一级圆盘，取出第一级的营养琼脂平板．盖上皿盖 。在皿盖上分别标出样品号和级别号，做好记录，例如标出1-1、1-2；2-1、2-2等 。
(5)细菌培养为了预防冷凝水珠出现，将平板翻转倒置于培养箱内进行培养，测定在36±1℃下培养48h的细菌数；真菌最佳培养温度在20～25℃；或者根据采样目的选择适当的温度培养 。
(6)样品培养后，用标准细菌菌落计数器．计数每一个平板上的菌落数，也可以用“阳性孔计数方法"，计数平板上的菌落数，然后用平板上的菌落数的数值，在“200孔采样器阳性孔修正表”中查出对应的修正后的菌落数 。
(7)结果计算
①菌落总数 。每次采样，将6个平板上的菌落数的总和除以空气采样体积，可求出每立方米(m 。)空气中的菌落数，以CFU／m3报告结果 。其中空气采样体积等于空气采样流量乘以采样时间 。空气中的菌落数可用式(6—8)计算：
C一1000(N1+N2)／30t(6-8)
式中，C为空气中的菌落数，CFU／m3；Nl、N2分别为第一级舌第二级平板上修正后的菌落数，CFU；30为空气采样流量，L／min；t为采样的时间，min 。
【空气微生物采样器】②可吸人菌落数的比例 。在六级安德森撞击采样器中，将第一级平板上的菌落数除以2个平板上的菌落数总和，可求出空气中可吸人粒子上的微生物所占的比例，用％表示 。

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